“兩蟲" (賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲)檢測(cè)

賈第鞭毛蟲是感染小腸的雙核鞭毛原生動(dòng)物寄生蟲。感染通常會(huì)導(dǎo)致慢性虛弱的腹瀉，體重減輕和吸收不良。飲用被污染的水可能會(huì)導(dǎo)致賈第鞭毛蟲病。傳播也通過(guò)直接接觸而發(fā)生，尤其是與無(wú)癥狀的攜帶者接觸以及食物污染。高風(fēng)險(xiǎn)類別包括幼兒，免疫功能低下的患者以及以前沒(méi)有接觸過(guò)的患者。

隱孢子蟲是脊椎動(dòng)物的原生動(dòng)物寄生蟲。在世界. 上大多數(shù)地區(qū),它與腹瀉病有關(guān)，是旅行者腹瀉的常見原因。該疾病是由厚壁卵囊傳播的，該卵囊對(duì)普通消毒劑和飲用水的常規(guī)氯化反應(yīng)具有顯著抵抗力。人與人之間的傳播很普遍。隱孢子蟲病是獲得性免疫缺陷綜合癥患者的一一種嚴(yán)重機(jī)會(huì)性感染。臨床表現(xiàn)包括腹瀉，腹痛，，嘔吐和體重減輕。在健康人中， 感染通常是自限性的。

在艾滋病和免疫抑制患者中，該病可能會(huì)持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)并可能會(huì)危及生命。目前“兩蟲"已被列入國(guó)標(biāo)GB/T 5749- 2006非常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。國(guó)標(biāo)GB/T 5750-2006中檢測(cè)方法源于EPA1623。方法流程為水樣過(guò)濾淘洗、免疫磁分離、熒光染色和鏡檢。在水樣的過(guò)濾淘洗步驟中，國(guó)標(biāo)描述了三種方法可選，其中Envirochek過(guò)濾淘洗方法為仲裁法。

北京格維恩科技有限公司作為PALL“兩蟲"檢測(cè)產(chǎn)品(Envirochek濾器、 多樣品洗脫振蕩器及試劑)國(guó)內(nèi)總代理，十幾年來(lái)與國(guó)內(nèi)疾控、環(huán)保、水務(wù)、第三方檢測(cè)、食藥監(jiān)、海關(guān)、高校及研究院合作開展“兩蟲"檢測(cè)項(xiàng)目，客戶數(shù)量過(guò)百家。同時(shí)提供EPA1623.1方法(2012年改進(jìn)版本、針對(duì)含有磁性物質(zhì)的復(fù)雜水樣顯著提高回收率)供客戶選擇。

水樣過(guò)濾易于使用。無(wú)需組裝或清潔過(guò)濾器架或洗脫設(shè)備。

可同時(shí)處理多份樣品，節(jié)省時(shí)間。

一次性成品，可避免交叉污染和假陽(yáng)性結(jié)果。

一般能夠回收70%以_ 上的靶標(biāo)生物。

濾膜孔徑小至1 um,能夠保留隱孢子蟲和賈地鞭毛蟲。

所有EnvirochekHV囊式采樣濾器均經(jīng)過(guò)完整性試驗(yàn)。

使用安全。無(wú)需處理或拆分可能受到污染的濾芯。

各囊式濾器均分別帶有序列號(hào),便于追溯。

Envirochek囊式采樣濾器已獲美國(guó)EPA方法1622和1623.1確認(rèn)與注冊(cè)。

Envirochek HV囊式采樣濾器專用于1,000 L或更多凈化水，經(jīng)確認(rèn)可用于50 L源水。

Envirochek HV囊式采樣濾器(產(chǎn) 品編號(hào): 12096和12097) 通過(guò)了英國(guó)DWI成品水監(jiān)管測(cè)試。

Envirochek囊式采樣濾器已在ISO/DIS 15553-2006中注冊(cè)。

水樣淘洗:PALL專用的洗脫振蕩器可以同時(shí)洗脫8個(gè)樣品，15分鐘即可完成。設(shè)備操作簡(jiǎn)單,不需要維護(hù)、清洗、消毒及額外的輔助設(shè)備如氣泵等。設(shè)備可靠性強(qiáng)，正常使用情況下，三年內(nèi)儀器出現(xiàn)硬件問(wèn)題免費(fèi)換新。

免疫磁分離IMS:利用DynalBead帶有特異性的“ 兩蟲"抗體磁珠與樣本中目標(biāo)蟲體抗原結(jié)合從而高效選擇性分離。

染色鏡檢利用BTF生產(chǎn)的Easystain染色試劑盒，內(nèi)含配制好的FIFC及DAPI染液及配套試劑，無(wú)需復(fù)染，染色效果、操作簡(jiǎn)單。鏡檢配置專用的研究級(jí)正置熒光顯微鏡，同時(shí)擁高像素圖像采集系統(tǒng)。圖像清晰，可保存。熒光模塊、物鏡等均可拓展。滿足客戶多種需求。

“兩蟲"檢測(cè)方法及系統(tǒng)介紹

我公司推薦使用的Envirochek“兩蟲"檢測(cè)方法是GB5749-2006國(guó)標(biāo)和GB/T5750-2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)測(cè)方法》中測(cè)定生活飲用水和水源水中賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的方法，也是GB/T5750-2006國(guó)標(biāo)規(guī)定的兩蟲檢測(cè)的仲裁法，同時(shí)也是美國(guó)EPA制定的測(cè)定水中賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的標(biāo)準(zhǔn)方法EPA1623 (EPA-821-R-99-66)。

賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲簡(jiǎn)述

1. 隱孢子蟲的生活史

隱孢子蟲（Cryptosporidium）是一種寄生性的原生動(dòng)物，其中感染人的是微小隱孢子蟲C. parvum。

隱孢子蟲的卵囊呈圓形，直徑約4~6微米，成熟卵囊內(nèi)含4個(gè)呈月牙形的子孢子和呈顆粒物狀的殘留體。

隱孢子蟲的生活周期包括無(wú)性生殖、有性生殖和孢子生殖三個(gè)階段，可在同一宿主體內(nèi)完成。隨宿主糞便排出的卵囊(oocyts)具有感染性，新宿主吞食了存在于水中的卵囊就會(huì)感染隱孢子蟲病。隱孢子蟲整個(gè)生活周期約需5~11天。

2. 賈第鞭毛蟲的生活史

賈第氏鞭毛蟲（Giardia）是一種寄生性的原生動(dòng)物，感染人的是腸賈第鞭毛蟲G.intestinalis。

孢囊呈橢圓形，長(zhǎng)約8~18微米，寬約5~15微米，未成熟的孢囊有2個(gè)核，成熟的孢囊具4個(gè)核。

其生活史由孢囊和滋養(yǎng)體兩個(gè)不同的發(fā)育階段組成。

由于賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲卵囊和孢囊的表面包裹著一層較厚的囊壁，因此具有非常強(qiáng)的環(huán)境抗性。常規(guī)消毒工藝的氯濃度不能有效滅活隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲，它們通過(guò)水廠構(gòu)筑物進(jìn)入供水管網(wǎng)，威脅人們健康。傳統(tǒng)檢測(cè)手段有嚴(yán)重的滯后性，不能及時(shí)準(zhǔn)確的報(bào)告水中有關(guān)兩蟲的信息。

3. 兩蟲的危害

隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲產(chǎn)生的卵囊和孢囊對(duì)環(huán)境有很大的抗性，人體只要攝入幾個(gè)就會(huì)生病。

賈第鞭毛蟲致病劑量為10~100個(gè)活孢囊，隱孢子蟲致病劑量?jī)H為1~10個(gè)活卵囊。

主要感染方式：主要通過(guò)患病動(dòng)物糞便中的卵囊污染食物和飲用水而感染人畜。

主要易感人群為：兒童、老人或免疫力低下的人群。

發(fā)病癥狀：頭暈、、腹痛、嘔吐、腹瀉、低燒甚至死亡等。

1993年美國(guó)Wisconsim州Milwaukee市兩蟲污染事件導(dǎo)致了約40萬(wàn)人受到感染，其中160多人死亡。

1998年夏，悉尼自來(lái)水公司在管網(wǎng)中檢出了高濃度的孢囊和卵囊，要求用戶將水煮沸后飲用，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)35天。

1997年美國(guó)對(duì)各水廠原水的月度調(diào)查表明：卵囊的高陽(yáng)性檢出率為10.4%，孢囊的高陽(yáng)性檢出率為31.3%。

德國(guó)有83%的水樣中檢測(cè)出有兩蟲，馬來(lái)西亞有90%檢出，香港有99%檢出，甚至在濾后水中也檢測(cè)出兩蟲。

美國(guó)國(guó)家于1997年7月~1998年12月調(diào)查結(jié)果顯示，4.62%~10.43%的水廠原水中有隱孢子蟲，而13.6%~31.25%的水廠原水中有賈第鞭毛蟲。在亞洲、非洲及拉丁美洲，每年有2.5~5億人次受到兩蟲感染。

“EPA1623方法"概述

1. 美國(guó)EPA于1996年12月起草，于1999年1月修正并通過(guò)測(cè)定隱孢子蟲的1622(EPA-821-R-99-001)方法，在此基礎(chǔ)上能同時(shí)測(cè)定隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的1623 (EPA-821-R-99-66)方法于1999年4月被批準(zhǔn)進(jìn)行樣本分析。

2. EPA1623 方法中主要推薦并在實(shí)驗(yàn)中采用的是Pall公司的Envirochek濾器。

3. 為了保障飲用水安全，實(shí)施優(yōu)質(zhì)供水，國(guó)家建設(shè)部在2005年6月1日正式實(shí)施的《城市供水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》（CJ/T 206-2005）中增加了賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的微生物指標(biāo)。要求：<1個(gè)/10升水。

4. 在2006年12月29日發(fā)布的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5749-2006）中增加了賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的微生物指標(biāo)。要求：<1個(gè)/10升水。在實(shí)驗(yàn)方法的淘洗/濃縮部分,首先推薦了Envirochek方法(Pall公司)，供選的還有Filta-Max方法和Filta-MaxXpress快速法。

5. Envirochek方法(Pall公司)作為國(guó)標(biāo)的方法，同時(shí)也是國(guó)標(biāo)規(guī)定的仲裁方法。

6. 為了完成國(guó)標(biāo)的檢測(cè)要求，開展行之有效的“兩蟲"檢測(cè)工作，建立“兩蟲"檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室勢(shì)在必行。我國(guó)一些供水企業(yè)和研究部門已經(jīng)開始了這方面的工作。

7. 目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)建立“兩蟲"檢測(cè)系統(tǒng)的城市有天津、太原、深圳、東營(yíng)、北京、大慶、南京、昆明、濟(jì)南、廈門、重慶、中山、廣州、青島、杭州、佛山、南寧、成都、株洲、上海、無(wú)錫、長(zhǎng)沙等等，其中除廣深等早期自建實(shí)驗(yàn)室之外，其余90%以上的“兩蟲"檢測(cè)系統(tǒng)均是由北京格維恩公司和廣州格維恩公司設(shè)計(jì)實(shí)施的。 

 “EPA1623方法"內(nèi)容簡(jiǎn)述

一、方法概述

1. 本方案是通過(guò)對(duì)過(guò)濾、免疫磁分離（IMS）和免疫檢驗(yàn)化驗(yàn)（FA）顯微鏡等方法來(lái)確定水中的隱孢子蟲(CAS登記號(hào)137259-0-8)和賈第鞭毛蟲（CAS登記號(hào)137259-49-5）的特性與濃度，隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲可以通過(guò)4'，6-Diamidino-Phenylindole(DAPI)著色和差分干涉相襯（DIC）顯微鏡檢驗(yàn)法進(jìn)行確定。本方案經(jīng)批準(zhǔn)可用于地表水，但如果實(shí)驗(yàn)室證明符合該方案執(zhí)行驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，也可以用于其它水樣。

2. 本方案符合美國(guó)調(diào)查和探測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)了美國(guó)EPA認(rèn)證。本方案以的專家團(tuán)所提供的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)為基礎(chǔ)。專家團(tuán)負(fù)責(zé)提供一種用于回收與探測(cè)原生動(dòng)物改進(jìn)草案，能夠通過(guò)最小的附加研究來(lái)檢測(cè)和實(shí)現(xiàn)。

3. 本方案不用于鑒定隱孢子蟲或賈第鞭毛蟲種類或其它原寄主種類，也不能確定探測(cè)到的卵囊和包囊的活性及其侵染性。

4. 本方案應(yīng)由精于通過(guò)過(guò)濾，免疫磁分離和免疫檢驗(yàn)化驗(yàn)對(duì)隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲進(jìn)行探測(cè)的人員使用。第22.2部分把這類人定義為分析員。不熟悉通過(guò)本方案技術(shù)對(duì)環(huán)境樣本進(jìn)行分析的試驗(yàn)室應(yīng)獲得使用水樣過(guò)濾技術(shù)、免疫磁分離和單克隆抗體熒光抗體著色，利用明場(chǎng)和差分干涉相襯（DIC）顯微鏡檢驗(yàn)法對(duì)生物微粒微觀檢驗(yàn)的技術(shù)。

二、主要實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)

1. 通過(guò)水樣過(guò)濾，把卵囊、包囊和外來(lái)物質(zhì)留在過(guò)濾器上。

2. 洗脫與分離

2.1 過(guò)濾器上的物質(zhì)經(jīng)過(guò)洗脫，洗脫物通過(guò)離心分離作用使卵囊和包囊成為球形，同時(shí)分離出的上清液被吸取。

2.2 卵囊和包囊被與抗隱孢子蟲和抗賈第鞭毛蟲抗體結(jié)合的磁珠附加裝置磁化。通過(guò)使用磁體，磁化后的卵囊和包囊從其它物質(zhì)中分離，其它物質(zhì)被清除。接著，磁珠聯(lián)合體從卵囊和包囊中分離。

3. 計(jì)數(shù)

3.1 卵囊和包囊在穴槽載玻片上被磁熒光標(biāo)記的單性抗體和4'，6-Diamidino-Phenylindole(DAPI)溶液著色。用熒光和差分干涉相襯（DIC）顯微鏡檢驗(yàn)法對(duì)著色樣本進(jìn)行檢驗(yàn)。

3.2 通過(guò)仔細(xì)觀察每一個(gè)載玻片，對(duì)符合隱孢子蟲卵囊和包囊大小，外形和熒光特性的對(duì)象進(jìn)行定性分析。

3.3 通過(guò)計(jì)算載玻片上被確定為卵囊和包囊的對(duì)象來(lái)進(jìn)行定性分析。

3.4 通過(guò)使用再現(xiàn)校準(zhǔn)和過(guò)濾，免疫磁分離，著色和顯微鏡檢驗(yàn)系統(tǒng)來(lái)保證質(zhì)量。

（以上流程詳見附件“隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲檢測(cè)方法講稿"）

本系統(tǒng)采用《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》GB/T 5750.12-2006，

同時(shí)也符合美國(guó)EPA第1622和1623號(hào)方法，

英國(guó)DWI（飲用水監(jiān)察署）第1524號(hào)方法，

ISO（國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織）第15553號(hào)方法。

Envirochek®及Envirochek HV膠囊式取樣過(guò)濾器

用于從水源水或成品水中濃縮、回收隱孢子蟲卵囊和賈第鞭毛蟲孢囊

簡(jiǎn)單易用，過(guò)濾支架或洗提裝置無(wú)需裝配，也無(wú)需清洗。

 可同時(shí)處理多個(gè)樣本，從而節(jié)約時(shí)間。

一次性使用的設(shè)計(jì)，消除交叉污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性可能。

對(duì)于目標(biāo)有機(jī)體的回收率通常高于70%。

利用孔徑為1μm的濾膜，99%截留收集隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲，從而消除了假陰性可能。

更高的使用安全性。作為自主式膠囊式過(guò)濾器，意味著過(guò)濾元件無(wú)需處理，也不需分割。

序列編碼，以供追蹤。

 Envirochek HV膠囊式過(guò)濾器均已通過(guò)完整性測(cè)試。

應(yīng)用：Envirochek膠囊式取樣過(guò)濾器

有效過(guò)濾面積：1,300 cm2

外形尺寸

長(zhǎng)度：21.6厘米（8.5英寸）

直徑：6.1厘米（2.4英寸）

入口/出口連接

12.7 mm (1/2 in.) 倒刺直軟管

洗提能力

下限為127mL